摘要：你怎么解决原代细胞培养的问题？错误1：一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间。纠正1：原代细胞对解冻过程非常敏感，因此重要的是将小瓶放入37的水浴中并保持它，轻轻旋转它，直到内容物刚刚解冻。之后，应立即将...
你怎么解决原代细胞培养的问题？
错误1：
一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间。
纠正1：
原代细胞对解冻过程非常敏感，因此重要的是将小瓶放入37的水浴中并保持它，轻轻旋转它，直到内容物刚刚解冻。之后，应立即将小瓶从水浴中取出，并转移至无菌控制台。确保你的培养瓶在解冻前准备好，这样它就可以立即用于接种细胞并放在培养箱中。
错误2：
解冻匹配小瓶后，直接离心原代细胞。
纠正2：
我们不建议解冻后离心细胞，因为离心程序比少量二甲基亚砜残留物更有害。请记住，在原代细胞恢复的第二天更换培养基，以去除任何残留的二甲基亚砜。
错误3：
让原代细胞变得太融合。
纠正3：
当生长到100%融合时，原代细胞会衰老。请记住，原代细胞不是100%纯的，因此最大限度地减少受污染细胞的生长非常重要。我们建议原代细胞在90-95%细胞融合时进行传代培养。
错误4：
原代细胞传代过程中过度的胰蛋白酶消化。
纠正4：
当细胞传代培养时，使用低浓度的胰蛋白酶，并在显微镜下密切监测细胞。另外，切记要在胰蛋白酶消化后完全中和细胞内的胰蛋白酶，因为任何活性的胰蛋白酶都会损伤细胞。
错误5：
原代细胞很容易再冷冻。
纠正5：
一般来说，我们不建议冷冻原代细胞，因为它会促进细胞老化和/或导致功能改变。原代细胞非常敏感，冷冻可能导致细胞死亡或损伤。
错误6：
原代细胞可以无限增殖。
纠正6：
与细胞系不同，原代细胞的扩增能力有限。我们建议尽早使用原代细胞，以防止基因漂移。此外，如果您使用的是增殖困难的细胞类型，您应该密切监测细胞形态，因为随着时间的推移，少量混合细胞(如成纤维细胞)可能会大量生长，成为主要细胞。
错误纠正后就该步入正轨啦——
应如何进行冻存细胞的培养？
以下步骤以单管冷冻保存细胞的实验方案为例。
准备一个装有37水的烧杯。
从液氮库中取出一管细胞，注意保护手和眼睛。
松开管套1/4圈，等待10秒钟，释放可能残留在螺纹中的液氮，然后重新拧紧管套。
将冻存管下部放入37C的水浴中解冻，直到冻存管内只剩下一个小冰芯，这样可以快速解冻细胞。
用消毒剂擦拭管体外表面，然后移至二类a型层流细胞培养通风柜。
打开试管盖，用1毫升移液管上下吹细胞悬液，以分散细胞。
台盼蓝染色
从试管中吸取20微升细胞悬液，用20微升台盼蓝溶液稀释。
用血细胞计数板测定每毫升悬浮液中活细胞的数量。
将试管中的悬浮液(1毫升)稀释至产品说明中推荐的浓度。
向25 cm2培养瓶中加入5 mL细胞悬液，或向75cm2培养瓶中加入15 mL细胞悬液。
摇动烧瓶中的培养基，彻底分散细胞。许多类型的细胞会很快粘附在壁上，如果细胞在传代后不立即摇动，细胞可能会生长不均匀。
在37，5% CO2/95%空气和湿度的细胞培养箱中培养细胞。为了获得最佳效果，培养开始后至少24小时内不要干扰细胞。
是否可以对扩增后的细胞重新冻存？如果可以该如何操作？
当冷冻或增殖细胞从细胞库中购买时，它们可以被扩增和再冷冻。但冷冻保存可能会影响细胞的生长状态。以下实验方案为使用无蛋白冷冻培养基冷冻细胞提供了基本指导。
请注意：由于冻存设备与个人技术之间的差异，我们无法确保使用本方案冻存的细胞在复苏后能够保持活力，我们也无法为研究用户实验室冻存细胞的效果进行担保。
用37C水浴解冻没有蛋白质成分的冷冻培养基，或用4C水浴过夜解冻。
如果在水浴中解冻，请确保温度不超过37，不要将产品长时间置于37。
不含蛋白质的冷冻保存培养基在使用前应在4下彻底平衡。为了得到最好的效果，建议使用可以控制温度变化率的冰箱。如果没有可以控制温度变化率的冰箱，也可以使用细胞冷冻箱。
如果培养容器表面的细胞需要用酶试剂解离，应使用相应的终止溶液重新悬浮细胞，以中和酶的作用。
通过离心沉淀细胞。
除去上清液后，用不含蛋白质成分的预冷冷冻培养基以5x10E5至3x10E6细胞/ml的密度重悬细胞。
将细胞悬液装入适当数量的冷冻保存试管中。
尽快将电池冷却至4c。
如果使用温度变化率可控的冰箱，以每分钟1的速度冷冻样品，直到达到40.之后，以每分钟2摄氏度的速度降低到-90摄氏度左右。
如果使用细胞冻存盒：请按照说明准备好冻存盒。
为了获得最佳结果，建议您在电池温度降至80C后，尽快将冷冻储存管转移到液氮储存设备的气相中.
作为无蛋白冷冻培养基的替代品，可以使用推荐的冷冻细胞基础培养基，细胞冷冻可以添加10% FBS和10% DMSO。
组织块贴壁法分离细胞时：注意组织块贴壁2-3h后，补液时沿壁轻轻加入培养基，防止组织块漂浮。
